抗酸染色的基本原理

分枝杆菌的植物细胞内富含脂类物质，包围在肽聚糖的外侧，因此它们通常难以被染色。为了促进染色，需实施加温和延长染色时间。然而，当分枝菌酸与染剂融合后，便难以被酸碱性脱色剂褪色，因此被称为抗酸染色。齐-尼氏抗酸染色法在加热条件下，使分枝菌酸与石/炭酸复红牢固结合，形成抗酸性复合物，用盐酸乙醇处理时不会褪色。复染过程中，偏碱美兰染液继续应用，分枝杆菌将保持鲜红色，而其他细菌及背景物质则显现深蓝色。

制片步骤

涂片

使用左手持菌液试管，右手持接种环，从试管中取一环菌液，于载玻片中央涂抹成薄层（事先在背面做好标记）。也可以在载玻片中央滴一小滴无菌水，用接种环在斜面上挑取少量菌液与水滴混合涂抹为薄层。注意，在拔或塞试管塞时，先将试管口通过火焰稍作灼烧，最后要用火焰灭菌接种环。

干燥

涂片后应让其在室温下自然干燥，亦可在酒精灯上略加热迅速干燥，但应避免直接靠近火焰。

固定

常用高温固定法。手持载玻片一端，标本面朝上，在火焰外侧快速来回移动3至4次，大约耗时3至4秒。确保玻璃片温度不超过60℃，以保证可以安全触摸，待其冷却后进行染色。

染色过程

初染

滴加石/炭酸复红溶液2-3滴，在火焰高处缓慢加热，避免沸腾，如出现蒸汽需暂时离开。若染液蒸发过多，应适量再加染液以防干燥，保持加热5分钟，待标本冷却后用水冲洗。

脱色及复染

用碱性美兰溶液复染1分钟，然后水洗干净，使用吸水纸吸干，再进行油镜观察：

1. 油量适中。
2. 调节焦距时，注意与载玻片保持适当距离，避免损坏设备。
3. 应从下向上调节焦距。
4. 在使用油镜前，需先用低倍和高倍镜观察，确保目标位于视野中心。
5. 用左眼观察目镜，缓慢调节细调节器直至影像清晰。

结果判定

干燥后，使用油镜观察300个视野，观察时记录抗酸性细菌呈红色，其余细菌或细胞呈蓝色。报告方式包括：

• 未找到抗酸杆菌
• 找到抗酸杆菌±：可疑，发现1-2条/300视野
• 找到抗酸杆菌1+：发现3-9条/100视野
• 找到抗酸杆菌2+：发现1-9条/10视野
• 找到抗酸杆菌3+：发现1-9条/1视野
• 找到抗酸杆菌4+：发现≥10条/1视野

质量控制与注意事项

每次使用卡介苗作为阳性对照，大肠埃希菌ATCC25922作为阴性对照。在实验中需注意：

• 每一玻片应只涂抹一份标本，以避免混淆。
• 脱色时间需视涂片厚度调整，厚片可适当延长，直至无红色显现。
• 冬季室温较低时，染色时间应适当延长。
• 同一抗菌体上红色深浅可能不同，观察时需留意。
• 试剂用完后迅速盖好，避免挥发并储存于适宜条件下，避免高温、低温和阳光直射。
• 对玻片严禁加热以防损坏。
• 染色时应保持染液湿润，避免干燥。

使用EVO视讯进行实验不仅能提升检测效率，更能确保实验结果的精准与可靠。